重组DNA技术

在发现限制性核酸内切酶和连接酶后不久，遗传学领域开始使用这些分子工具从合成或天然存在的DNA的较小片段中组装人工序列。与连续DNA合成相反，使用重组方法的优势在于合成DNA长度与该合成长度的纯度百分比之间存在反比关系。换句话说，当您合成更长的序列时，由于当前技术的固有错误率，包含错误的克隆数会增加。尽管重组DNA技术更常用于融合蛋白和质粒的构建，已经出现了一些具有更大容量的技术，可以构建整个基因组。

聚合酶循环装配（PCA）使用一系列大约40至60个核苷酸长的寡核苷酸（或寡核苷酸），它们共同构成了要合成的DNA的两条链。这些寡核苷酸被设计成使得来自一条链的单个寡核苷酸在每个末端包含约20个核苷酸的长度，该长度与相反链上的两个不同寡核苷酸的序列互补，从而产生重叠区域。整个过程通过以下循环进行：（a）在60°C杂交；（b）通过Taq聚合酶和标准连接酶的延伸；（c）在95°C变性，形成逐渐更长的连续链，并最终形成最终的基因组。PCA用于产生历史上xxx个合成基因组，即Phi X 174病毒。

由丹尼尔·吉布森（Daniel Gibson）在J.克雷格·文特学院（J. Craig Venter Institute）任职期间设计的吉布森组装方法需要一组构成整个合成基因组的双链DNA盒。注意，盒的定义与重叠群不同，因为这些序列包含与其他盒同源的区域以便重组。与聚合酶循环组装不同，吉布森组装是一步式等温反应，具有更大的序列长度能力。因此，它可用于代替大于6 kb的基因组的聚合酶循环装配。

甲T5核酸外切酶进行在终端段咀嚼回反应，在5'个工作至3'方向，由此产生互补的突出端。突出端彼此杂交，Phusion DNA聚合酶填充任何缺失的核苷酸，并且切口用连接酶密封。然而，仅能使用这种方法合成的基因组是有限的，因为随着DNA盒长度的增加，它们需要在体外​​繁殖才能继续杂交。因此，吉布森装配通常与转化相关重组结合使用以合成大小为几百千个碱基的基因组。

合成基因组学中的转化相关重组（TAR）技术的目标是通过酵母人工染色体（YAC）进行的同源重组来结合DNA重叠群。重要的是YAC载体中的CEN元件，其对应于酵母着丝粒。该序列使载体具有以染色体方式表现的能力，从而使其能够进行同源重组。

首先，进行缺口修复克隆以产生DNA重叠群侧翼的同源区域。缺口修复克隆是聚合酶链反应的一种特殊形式，其中利用了延伸超过DNA靶序列的专门引物。然后，将DNA盒暴露于YAC载体，该YAC载体驱动同源重组的过程，从而连接DNA盒。聚合酶循环装配和TAR技术在2008年一起用于构建600 kb生殖支原体基因组，这是有史以来xxx个合成生物。在合成较大的支原体时也采取了类似的步骤几年后的基因组。